April 19,2010 11:14

淺談高效液相層析儀 (HPLC/high performance liquid chromatography) (一)

HPLC也就是,高效液相層析儀 (high performance liquid chromatography, HPLC),不過光聽名字是不知道這是做什麼的啦,簡言之這是分析的儀器之一,常用來檢測待測物,常常看CSI犯罪現場節目的朋友可以仔細看看,有時候也會有它的身影出現喔。


(這是一張常見的HPLC檢測報告)

上圖是常見的HPLC的檢測報告,除了圖譜上檢體裡許多的尖峰 (peak),我們也可以看到訊號的大小與retention time,右側也有Injection loopColumnTemperatureMobile phaseFlow rateDetector等資訊。如果使用完全相同的條件的話,應該也可以獲得類似的圖譜結果。

 

1.     功能?

若想要在一堆雜七雜八的玩意裡,檢測某化合物的濃度,至少要經過「分離」「檢測」這兩個步驟。不過光是分離就是一門大學問,檢體通常是五花八門,可能是病人的血液,也許是某河的底泥,裡頭幾乎是什麼東西都有,而要怎麼去分離一堆混合物呢?分析學家想出了讓「待測物去賽跑」的方式。

 

2.     原理?

很簡單的介紹HPLC的話,就是讓溶有待測物的液體流經充滿填充物的管柱 (column),而待測物裡的每個化合物,和column裡填充物的親和力皆不盡相同,所以在流過column後,親和力最低的待測物會先流出,親和力中等的次之,而和填充物產生最大親和力的待測物最後才會流出,因此可以達到分離的效果。

比方說,如果在清華大學前有兩名騎士,分別是一男一女,倘若外型和機車皆相仿,請問要怎麼區分他們呢?很簡單,就讓他們沿著光復路 (column)騎車,因為路旁有許多養眼的檳榔西施,所以男騎士 (待測物)會對檳榔西施 (填充物)產生比較大的親和力,所以其餘條件皆相同的情形下,晚到達終點的就會是男騎士!

HPLC的前身其實是GC (氣相層析儀),原理也是讓待測物通過管柱,讓親和力較高的待測物停留的時間久一點。但是HPLC並非以氣態,而是以液體的型態進入管柱。所以HPLC可以量測一些GC無法量測的化合物,如1)溶解度高2)無法受熱 (如蛋白質)之類的檢測物,就比較適合用HPLC來做檢測。而HPLC是將檢體溶解於液體裡,以高壓推入管柱,所以相較之下多了一項「使用什麼液體?」的參數,這類將檢體推入管柱的液體,我們稱為「移動相/Mobile Phase

待測物在管柱內,是同時和填充物以及mobile phase產生親和力,可以想像的是,待測物和填充物產生的親和力,會讓待測物延遲流出管柱,但相對的是,待測物和mobile phase產生的親和力,使得待測物被mobile phase黏住,一起流出管柱,所以會使得待測物加速流出管柱。所以選擇適當的mobile phase,搭配管柱填充物,可以讓檢體內大部份的待測物分離,擁有不同的流出時間,而流出的時間,我們稱為「滯留時間/Retention time

 

3.     HPLC最需要注意的地方

HPLC有幾個大忌,其中最致命的兩個是「氣泡」&「無法溶解的雜質 (或鹽類結晶),因為管柱是由填充物很緻密地塞滿,所以一旦有難以排出的氣泡或雜質,就會將跑道卡死,很像是行駛在山間小路上,卻有許多落石掉在路中間,不僅影響了車子的行進,使化合物的retention time受到影響變得無法分離,而且由於我們沒法弄台怪手將管柱裡的雜質排除,這支管柱就會塞死,從此掰掰。而最容易有氣泡、雜質或結晶的來源是注入的檢體,或是mobile phase,所以當我們製備檢體或mobile phase時,都要過濾或除氣,避免這些問題產生。

(待續!)

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